1.抗原的制备：

    标准菌株的选择：所用的菌种伤寒杆菌H901和伤寒杆菌O901应具有典型形态菌落及生化反应。在生理盐水中不发生自身凝集，与特异血清有高度凝集者可作为菌种。

    2.菌液的制备

   1) 原液制备：

    H菌液的制备：将合格的伤寒杆菌H菌株接种于普通琼脂的克氏瓶或大试管内 37℃孵育18—24小时。肉眼观察有无杂菌生长，必要时作镜检。用无菌甲醛生理盐水洗下菌苔，将洗下液体装入无菌试管内，置37℃恒温箱18—24小时以杀菌。得到原液。用作无菌试验即将菌液接种于肉汤及琼脂培养基培养4天，无活菌生长者才可使用。
O菌液的制备：将合格的伤寒杆菌H菌株依上法培养后，用无菌0.5%石灰酸盐水将菌苔洗下，洗液装入无菌试管置于37℃温箱中18—24小时杀菌得原液。经检查无菌时可以使用(如无伤寒杆菌O菌株也可用H菌株制备O抗原。即用0.5%石灰酸生理盐水洗下H菌菌液置100℃水浴60分钟，破坏其H抗原即为O菌液。

   2) 应用液的制备：

    合格的原液用标准比浊管计算含菌落数目后，用生理盐水稀释至每毫升含菌10亿。是为了应用液加入适量甲醛使其为0.25%，制备好的原液及应用液均保存在2—10℃冰箱中备用，有效期为1年。

    菌液浓度的计算及稀释法：

    菌液的浓度可用麦克伦特氏标准比浊法来测定，方法如下：

    a. 分别配制1%硫酸溶液及1%氯化钡溶液

    b. 取口径相等质地相同的试管10支，依下表所示分别将硫酸及氯化钡溶液加入，
封固管口，注明号码备用。

    管号12345678910

    1%BaCl2(ml)0.10.20.30.40.50.60.70.80. 91.0

    1%H2SO4(ml)9.99.89.79.69.59.49.39.29.19.0

    相当菌数(亿/ml)36912151821242730

    c. 将洗下的细菌原液放入与比浊管相同的试管中并予以一定稀释。与标准比浊管相比较，视其浊度相当于比浊管的第几管，然后将比浊管相当菌数乘以稀释倍数即可得到每毫升中所含细菌的数量。如细菌原液1：5稀释后其浊度与第3管相当，则原液每毫升含菌数为9ⅹ5=45亿。

    d. 菌液的稀释

    3.免疫方法

   1) 选择体重2—3千克的健康雄兔2—3只，由耳静脉采血1毫升，分离血清。与进行免疫用的细菌做凝集试验，测定有无天然凝集素。如无或微量时，该动物可用于免疫。

   2) 将已稀释的抗原按以下剂量及程序注入兔耳静脉。

日期第1天第5天第10天第15天第20天

注射剂量0.5ml、1ml1、5ml、2ml、2.5ml

   3) 末次注射后7天耳静脉采血1毫升，分离血清。用上述菌液作试管凝集试验，滴定抗菌血清中抗体的效价，效价在1：2000以上可放血。若效价不高可再增量注射菌液1—2次，再行试血。试血合格可颈动脉放血(方法见附录)。分离血清，加入防腐剂(如万分的硫化汞)放4℃保存备用。

原创作者：上海elisa生物技术有限公司