1	酶标包被板	12孔×8条	7	显色剂A液	6mL
2	标准品：8pg/mL	0.6mL	8	显色剂B液	6mL
3	20倍浓缩洗涤液	25mL	9	终止液	6mL
4	标准品稀释液	6mL	10	说明书	1份
5	样本稀释液	6mL	11	封板膜	2张
6	酶标试剂	6mL	12	密封袋	1个

备注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：8、4、2、1、0.5、0.25 pg/mL

【操作步骤】

1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。

2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。

3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；每孔再加入酶标工作液100μL；空白对照孔不加。

4、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。

6、显色：每孔先加入显色剂A 液50μL，再加入显色剂B液 50μL，37℃避光显色15min。

7、终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。

8、测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。

9、计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。*终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。

【注意事项】

1、实验严格按照说明书的操作进行，实验结果判定必须以酶标仪读数为准。

2、酶标包被板开封后如未用完，应立即装入密封袋中加干燥剂保存。

3、建议所有的标准品、样本和空白对照都做双份检测，取平均值，以减小实验误差。

4、若显色过浅，可适当延长底物温育时间。

5、为避免交叉污染，标准品、样本和空白对照每加一个就要更换一次吸头；酶标工作液、样本稀释液和底物等公共组分，要悬臂加样，不得碰到微孔；不得重复使用封板膜。

6、试剂盒保质期内使用，不同批号的试剂不得混用。

7、底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

【操作程序总结】

准备试剂，样品和标准品

加入准备好的样品、标准品和酶标工作液，37℃反应60分钟

洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色15分钟

加入终止液

15分钟之内读OD值

计算

【需要而未提供的试剂和器材】

1、37℃恒温箱

2、标准规格酶标仪

3、精密移液器及一次性吸头

4、蒸馏水

5、一次性试管

6、吸水纸

【样本要求】

1、样本不能含叠氮钠（NaN₃），因为叠氮钠（NaN₃）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。

2、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能立即试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

3、样本应充分离心，不得有溶血及颗粒。

【贮藏】

2-8℃，避光防潮保存。

【有效期】

6个月

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