一、酶联免疫组化的关键环节
1、标本固定
固定的目的：
①防止标本从玻片上脱落；
②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；
③固定的标本易于保存。
2、脱水、石蜡包埋和制片
脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要wan全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。
3、脱蜡和水化
目的是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
4、抗原修复
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。
5、细胞通透
目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
6、灭活内源性过氧化物酶和生物素
在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10-30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4度避光保存。
7、血清封闭
组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
8、一抗和二抗浓度和孵育时间
一抗孵育条件在免疫组化反应中重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有4度、室温、37度，其中4度效果佳；孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min，具体条件还要摸索。
二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。
9、抗体稀释液
其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，我一直用国产的用抗体稀释液，一段时间在换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果，后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。
10、切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）
为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min.
11、DAB显色
背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几或几十）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；DAB显色时间很长才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短）；另一方面就是封闭时间过长。
12、复染
目的是形成细胞轮廓，从而好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数，数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。染色深则分化时间稍长些；染色浅则再置于苏木素中染色。盐酸酒精是分化，氨水是返兰，作用不同片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数然后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰。
13、封片
为了chang期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。
二、免疫荧光方法中的重要环节
1.冰冻切片制备
2.组织切片固定
3.血清封闭
4.一抗孵育条件
5.二抗孵育条件
6.复染
7.封片
8.切片清洗
注：
1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
2）温柔冲洗，防止切片的脱落。
3）冲洗的时间要足够，才能che底洗去结合的物质。
原创作者：上海elisa生物技术有限公司
