一、目的研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低经常影响RT-PCR、cDNA库构建和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
二、主要试剂
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
1. Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注重操作。
2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套，样品尽可能盖严。
3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。
4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特别结构，可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。2-8℃ 避光保存一年。
三、准备工作
1.在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用）。
2.将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37℃ 或室温下处理过夜。
3.将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。
4.灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。
四、实验步骤如下
1.取50~100mg的组织加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器打匀（Trizol 先放于冰上）。
2.将匀浆室温放置5 min。
3.加入200 μl 剧烈震荡混匀30s，冰上静置3 min。
4.12000 rpm，4℃ 离心15 min。
5.将上清液小心转移到新的1.5 ml离心管中（取400 μl ），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15 min。（此步中留意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿滥。）
6.12000 rpm，4℃ 离心15 min 。
7.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。
8.用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700 μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。（此时RNA是不溶解的）
9.8000 rpm，室温离心10min。
10.尽可能地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。
11.真空离心干燥3~5分钟，或放在室温下使乙醇挥发掉。
12.沉淀用30 μl DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68 ℃处理10 min。
13.RNA检测
①测定样品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μg/ ml RNA计算RNA的产量。OD260/OD280在1.8-2.0 。
②进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳确定RNA的完整性和污染情况。
原创作者：上海elisa生物技术有限公司
