每个进过实验室的学生，都有一部属于自己的血泪史，做实验看似简单，实则一步一个深坑。想要做好WB实验可不是一件容易的事，就算是实验老手，一不小心也会出现失误。为了解决大家实验方面的困扰，劲马小编为大家总结了一些在做WB实验过程中会出现的一些问题，一起来学习下吧。
实验简介：
WB，蛋白质印迹（Western blotting）又称免疫印迹（immunoblotting）,是采用印迹技术将蛋白质转移到膜上，再根据抗原-抗体的特异性结合，检测复杂样品中的某种蛋白的方法，该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验原理：
WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上，再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相对应的抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。
1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？
①细胞中不表达这种蛋白质——换一种细胞；
②细胞中的蛋白质被降解掉了——加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；
③抗体不能识别目标蛋白——多看看说明，是否有问题；
④酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。
2.Westernblot结果中的背景为什么较高?
①膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
②一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择适宜的抗体稀释度。
③一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。
④膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
⑤检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
3.Westernblot结果中杂带为什么那么多？
①目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等)，本身可以呈现多条带——查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
②目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。
③样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
④上样量过高，太敏感——适当减少上样量。
⑤一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。
⑥一抗不纯——纯化抗体
⑦一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。
4.为什么Westernblot结果中无信号或显示信号弱？
①检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
②检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
③转移或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
④抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
⑤一抗孵育时间不足——建议4℃结合过夜。
⑥二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。
⑦洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
5.为什么WB实验条带连在一起？
①检查用的胶的浓度和靶标蛋白的分子量是否适合
②上样量过高，有的人怕蛋白太少，蛋白浓度又低，蛋白加的太多，一般上样量20-25ug即可
③样品离子浓度高
④拔完梳子后，加样孔有残留的胶，这样上样量就少了，因此建议，拔梳子后一定要用水把残留的胶冲净，但也要注意，水一定要吸干，否则和残留胶一样会导致同样的结果。
⑤拔梳子时不要左右摇动，避免破坏加样孔底部。
⑥上样要迅速，否则会引起样品扩散。
⑦上样与跑电泳之间的间隔太长,尽量缩短时间间隔。
⑧装配三明治结构要迅速。
⑨电泳的电压太高，发热导致扩散。
⑩降低一抗浓度。
6.“微笑条带”电泳条带或整体出现“︶”形状?
①电泳速度过快——可通过减少电压等减慢电泳速度。
②电泳温度过高，使得胶变形——可在冷室或者冰浴中进行电泳或者改变电泳pH。
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