ELISA（免疫酶联吸附实验）是免疫学基础实验，大部分生命科学域的科研工作者对其都不陌生。因为其特异性强，灵敏度高，在基础科研和临床诊断中，ELISA技术都应用广泛。
ELISA实验步骤少，流程短，操作简单，单次实验3-6小时即可得到结果，实验小白也可以很快的上手。但是，很多人的实验结果很不理想，都是易学难精，上手容易，但想要得到稳定的结果，还是要花一点心思的。劲马生物在这里汇总了一些做ELISA的客户咨询我们的问题，一起来学习下吧！
1.ELISA可以检测胞内蛋白么？
答：可以的，大部分ELISA指标均为炎症因子、趋化因子等分泌类型蛋白，支持的样本类型也多为血清、血浆、细胞培养上清等液体样本。如需检测胞内蛋白，先需要确认待测指标是否在胞内表达，然后选用支持组织匀浆样本的ELISA试剂盒即可，将组织样品或细胞样品进行裂解，提取胞内蛋白后进行蛋白定量，每孔上样总蛋白量一致即可。
2.试剂盒里面有捕获抗体么？
答：即用型ELISA试剂盒中，捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上，没有单独的捕获抗体提供，直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。非即用型的ELISA试剂盒会有捕获抗体提供，需按照说明书推荐的工作浓度，用稀释液稀释后自行包被。
3.捕获抗体如何包被在96孔板上？
答：如果选用的是即用型ELISA试剂盒，无需进行抗体包被，因为试剂盒中的检测抗体已经事先包被在检测板中；如果是非即用型的ELISA试剂盒，需要自己在实验提进行抗体包被，简要步骤入下：先，要选择ELISA别的板子，材质应为聚苯乙烯；然后用抗体包被液将捕获抗体稀释（pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl）成工作浓度，再每孔加100 μl（96孔板加样量）稀释后的捕获抗体，室温或4℃过夜包被，然后进行洗板和封闭之后再次洗板即可使用，如需保存，则需要真空冻干后保存。
4.做实验怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢？多大是高多小是低？
答：需要根据文献推测，一般在健康人样本中，炎症因子表达很低，接近ELISA检测下限，样品无需稀释或1:1稀释即可，如已知为炎症疾病或造模样本，可参考文献，在预实验中设置1:10-100（或更高）的稀释比例，预实验检测后确定浓度进行正式实验。
5.ELISA实验中，检测计算抗原的浓度，临界值怎么确定？
答：根据曲线测定的浓度，建议落在标准曲线的中间位置较好，限不要超过标准曲线的上下限，如果超出较多，会影响计算结果准确性，建议调整稀释比例。
6.副孔差别比较大，是没洗干净吗？
答：复孔值差异较大，主要原因应考虑加样是否准确，洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。加样应注意移液器量程，以及枪头残留问题；洗板过程应注意不要有残留液体，需要进行拍干操作；孵育过程要更换封板膜，拍干过程要换吸水纸，避免交叉污染。
7.加完终止液之后测的几次数据差别也蛮大，是什么原因？
答：加完终止液后，显色反应也不是永远停止，形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深，建议在15 min内读数。
8.样本总是在标准曲线之外，稀释100倍也是，怎么办？
答：在设置稀释倍数之，需要参考相关文献，对于一些表达高的蛋白，确实会出现这种情况，之小编接到过的案例，样品需要稀释10000倍，目的蛋白才落在检测区间内。建议继续提高稀释比例。
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原创作者：上海elisa生物技术有限公司
