细胞培养，是一件需要不断积累的实验室必备技能，而细胞消化是细胞培养中不是那么复杂的一个步骤，虽然这个步骤不难，但是还是有很多人会“倒”在这一步上，比如对一些增殖比较快的细胞来说，如果你没有掌握好细胞消化的时间，那么，这些细胞就很有可能会由于营养物质缺乏或者细胞接触性抑制而导致状态变差或死亡，这样你的实验就不可避免的延期了，所以，细胞消化也需要我们好好去探索一番。

当细胞长满需要分盘的时后，就要想办法让细胞和培养底物说再见！也就是所谓的细胞消化（Cell Detachment）。常见细胞消化法有以下三种：

1、物理机械法

直接用液体吹打或用刮刀，施予外力让细胞与培养底物分离；适用于贴壁性弱的细胞传代，但相较于其它消化方法，这种外力无法量化控制，细胞分散效果差，且可能会造成大量细胞破损，使内容物释放到培养基，进而影响细胞传代状态。

2、离子螯合法

细胞膜表面蛋白大多需要钙、镁离子来维持与胞外基质的稳定键结，当然也包含各种黏附蛋白（例：整合素、钙黏着蛋白、桥粒等），螯合剂会在不破坏细胞膜表面蛋白的状况下，抽离这些离子，使黏附蛋白失活而减少细胞-细胞间及细胞-底物间的连接作用，让细胞较容易在施予外力时，脱离培养底物并促进细胞分散。

0.02% EDTA是细胞传代较为常用的离子螯合剂，在37℃作用效果较为佳（消化较敏感的细胞可在4℃作用），适用于消化一般贴壁性细胞或细胞表面标记实验细胞。

但EDTA无法用血清终止其反应，所以在消化细胞后必须用缓冲盐溶液（如：PBS）清洗离心，以免影响后续细胞贴盘效果。

3、酶消化法

用蛋白水解酶消化连接细胞及培养底物的蛋白质，适用于消化贴壁性稍强的细胞。

（１）胰蛋白酶（Trypsin）

为一种来自于胰腺的丝氨酸蛋白酶；能辨识并剪切胜肽链中的赖氨酸（Lys）和精氨酸（?Arg）羧基端（两者紧跟脯氨酸状况除外），所以能直接作用在细胞外的黏附蛋白及胞外基质上，但如果作用时间过长，细胞膜上內嵌的其他蛋白也会被水解，导致细胞膜受损；不同细胞适合的胰蛋白酶使用浓度及作用时间都各有不同。

使用胰蛋白酶消化，请先用不含钙、镁离子的平衡盐溶液清洗细胞，因为血清中的抗凝血酶III及平衡盐溶液中的钙、镁离子，都会降低胰蛋白酶活性，导致消化效果不佳；消化完毕后，可直接用含血清的培养基或其他胰蛋白酶抑制剂终止消化反应。

（２）胶原酶（Collagenase）

为一种胶原水解酶，大多由细菌提取而来；能辨识并剪切Pro-X-Gly-Pro胜肽序列，而此序列在胞外基质主成分-胶原蛋白中出现的频率比一般蛋白高很多，使得胶原酶能较一的作用在胞外基质上，所以对细胞的伤害比胰蛋白酶小，且在钙、镁离子环境中仍有活性，可用PBS和含血清的培养液配制，操作简便，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。

细胞消化小技巧

不一定要一次把所有细胞都要消化下来！晃动培养盘并在显微镜下用肉眼观察，只要70~80%细胞都收缩了或超过适合消化时间，就该终止消化反应，如果细胞量够即可进行后续传代或实验步骤；如果细胞量不够，则可视情况用不含钙、镁离子的平衡盐溶液清洗仍贴壁的细胞，再进行一次消化反应。

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